中國科學(xué)院西北高原生物研究所閆淑萍，王碩，陳濤，申誠，楊麗，李玉林和青海金麥杞生物科技有限公司趙景陽(yáng)，丁永淵，孔令繁為研究黑果枸杞花青素提取物(anthocyanin extract of Lycium ruthenicum Murr., AEL)對急性痛風(fēng)性關(guān)節炎(acute gouty arthritis, AGA)大鼠的作用,將60 只雄性SD 大鼠,隨機分為正常對照組、模型對照組、陽(yáng)性對照組、AEL 高劑量組(238.0 mg/kg)和AEL 低劑量組(59.5 mg/kg),每組12只,分為2 批,每批6 只。第一批動(dòng)物灌胃2 周,第二批動(dòng)物灌胃4 周后,采用50 mg/mL 微晶型尿酸鈉(microcrystalline sodium urate, MSU) 0.2 mL 注射到大鼠右踝關(guān)節誘導大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節炎模型,評價(jià)AEL 對AGA 大鼠踝關(guān)節腫脹和跛行步態(tài)的改善效果。所有動(dòng)物繼續灌胃至5 周,采用質(zhì)量分數2.5%的氧嗪酸鉀飼料喂食誘導高尿酸血癥模型,測定造模2 h、3 h 后大鼠的血清尿酸水平。研究發(fā)現,與模型對照組比較,灌胃2 周,AEL 高劑量能明顯緩解大鼠造模6 h 后踝關(guān)節腫脹,改善跛行步態(tài)；灌胃4 周,AEL 高、低劑量均能明顯緩解大鼠造模后6 h、24 h 踝關(guān)節腫脹和改善造模6 h 后跛行步態(tài),AEL 高劑量還能明顯改善造模24 h 后跛行步態(tài)；灌胃5 周后,AEL 高、低劑量均能明顯抑制氧嗪酸鉀導致的大鼠血清尿酸升高。結果表明,AEL 能從抗炎和降尿酸兩個(gè)方面對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節炎表現出明顯改善作用。

由于經(jīng)濟發(fā)展帶來(lái)的生活方式及飲食結構的變化,痛風(fēng)性關(guān)節炎發(fā)病率逐年增長(cháng)且呈現年輕化趨勢,全球痛風(fēng)性關(guān)節炎患病率約達10% ^[1-2]。痛風(fēng)性關(guān)節炎分為急性期、間歇期和慢性痛風(fēng)石期,其中急性痛風(fēng)性關(guān)節炎(acute gouty arthritis, AGA)是由于機體嘌呤代謝紊亂、血清尿酸水平升高,尿酸鹽沉積在關(guān)節囊、滑囊、軟骨和其他組織中,從而刺激關(guān)節引起的關(guān)節滑膜及周?chē)M織的病損或炎癥反應的急性發(fā)作^[3-4],早期發(fā)病隱匿,一旦發(fā)作難以根治且易反復,臨床主要表現為關(guān)節紅腫灼熱、劇烈疼痛、行動(dòng)不便,常伴隨著(zhù)腎臟疾病和關(guān)節的不可逆損傷,嚴重影響患者的生活質(zhì)量^[5]。目前,治療急性痛風(fēng)性關(guān)節炎以消炎鎮痛和降低血清尿酸為主^[6],臨床常用秋水仙堿聯(lián)合非布司他、溴苯馬龍以及非甾體類(lèi)藥物等西藥治療,雖然效果明顯,但停藥后易復發(fā),長(cháng)期服用還會(huì )出現胃腸道反應及肝腎功能損傷^[7]。中醫藥治療痛風(fēng)歷史悠久,具有多途徑、多層次的優(yōu)勢,且安全性更高^[8-9],因此,在天然產(chǎn)物中尋找具有防治痛風(fēng)和降尿酸的功能性成分以及以此為基礎開(kāi)發(fā)相關(guān)功能性食品成為發(fā)展大健康產(chǎn)業(yè)新的熱點(diǎn)。

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是茄科枸杞屬多棘刺落葉灌木,其果實(shí)富含花青素、多糖等活性成分,是目前發(fā)現的花青素含量最高的植物^[10]。黑果枸杞花青素屬于類(lèi)黃酮物質(zhì),具有抗氧化、抗疲勞、調節血脂等多種生物活性^[11 -13]。近年來(lái),花青素的抗炎活性受到廣泛關(guān)注,并且有研究報道紫甘薯中的花青素具有降尿酸作用^[14 -15],但關(guān)于黑果枸杞花青素抗炎和降尿酸的研究鮮有報道。微晶型尿酸鈉(microcrystalline sodium urate, MSU)誘發(fā)的急性關(guān)節炎,因表現出早期急性發(fā)作,迅速出現高峰和隨后緩解的特點(diǎn),符合人體急性痛風(fēng)性關(guān)節炎的臨床癥狀,且操作簡(jiǎn)單、成功率高而成為國際上常用的AGA 模型,被廣泛用于篩選具有改善急性痛風(fēng)性關(guān)節炎作用的天然產(chǎn)物；氧嗪酸鉀是尿酸酶抑制劑,能在短時(shí)間內快速升高血清尿酸。因此,本研究采用MSU 誘導大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節炎模型和氧嗪酸鉀飼料誘導大鼠高尿酸血癥模型,分析黑果枸杞花青素提取物(anthocyanin extract of Lycium ruthenicum,AEL)對模型大鼠踝關(guān)節腫脹、跛行步態(tài)、血清尿酸水平等指標的影響,從抗炎和降尿酸方面評價(jià)AEL 對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節炎的作用,以期為黑果枸杞資源的多元化開(kāi)發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動(dòng)物

SPF 級SD 大鼠60 只,雄性,實(shí)驗動(dòng)物使用許可證號:SYXK(津)2016-0009,由北京維通利華實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物飼養符合國家實(shí)驗動(dòng)物福利指南及實(shí)驗動(dòng)物倫理規范。飼養條件:標準屏障系統動(dòng)物房,溫度(22 ±2) ℃,濕度40% ～60%,12 h 光照晝夜交替。

1.2 實(shí)驗原料與試劑

黑果枸杞,由青海金麥杞生物科技有限公司提供,中國科學(xué)院西北高原生物研究所藏藥標準化與新藥研發(fā)實(shí)驗室鑒定為黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)的干燥果實(shí)；秋水仙堿片,西雙版納藥業(yè)有限責任公司；生理鹽水,河北天成藥業(yè)股份有限公司；尿酸檢測試劑盒(C012-2),南京建成生物工程研究所；微晶型尿酸鈉和質(zhì)量分數2.5%氧嗪酸鉀飼料,天津藥物研究院新藥評價(jià)有限公司；LESINURAD,上海再啟生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設備

Multiskan FC 型酶標儀,美國賽默飛世爾科技有限公司；PV-200 型足趾容積測量?jì)x,成都泰盟科技有限公司；ECA522 型電子天平、ECC2201 型電子天平,南京伯尼塔科學(xué)儀器有限公司；CTXNW-110B 型循環(huán)超聲提取機,北京宏祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；GQ105B 型管式離心機,上海浦東天本離心機械有限公司；GLZ-1B 型冷凍干燥機,上海浦東冷凍干燥設備有限公司；SJN-150-00 型雙效濃縮器,浙江溫兄機械閥業(yè)有限公司；BM-40 型純水機,北京中盛茂源科技發(fā)展有限公司。

1.4 黑果枸杞花青素樣品的制備

稱(chēng)取10 kg 黑果枸杞干果去梗、破碎,過(guò)60 目篩,置于超聲提取機中,加150 L 去離子水超聲提取30 min,超聲功率500 W,提取完成后放出提取液,再加150 L 去離子水,重復上述提取過(guò)程。合并兩次水提液約280 L,20000 r/min 離心5 min,收集上清液。上清液以100 L/h 流速泵入大孔樹(shù)脂柱(樹(shù)脂柱規格:100L,樹(shù)脂型號:AB-8,樹(shù)脂量:35 kg),用100 L 去離子水洗脫后,再用300 L 體積分數為50%的乙醇洗脫,收集洗脫組分,在45 ℃、 -0.07 MPa條件下用雙效濃縮器減壓濃縮得到濃縮液10 L,置于冷凍干燥機中冷凍干燥得到黑果枸杞花青素提取物595.2 g,經(jīng)鑒定該組分花青素質(zhì)量分數為30.1%。

1.5 動(dòng)物分組與處理

選用健康SD 大鼠60 只,雄性,體重185 ～210 g,適應性飼養一周后隨機分組。分別為正常對照組、模型對照組、陽(yáng)性對照組、AEL 高劑量組(238 mg/kg)和AEL 低劑量組(59.5 mg/kg),每組12 只,分兩批(6 只/批)。按上述分組灌胃,其中正常對照組及模型對照組灌胃給予等量蒸餾水,陽(yáng)性對照組在造模5 天前灌胃給予秋水仙堿(1 mg/kg),灌胃容積均為10 mL/kg,每天一次。第一批灌胃2周,第二批灌胃4 周。

1.6 急性痛風(fēng)性關(guān)節炎大鼠踝關(guān)節腫脹度的檢測

取1.5 節的第一批大鼠進(jìn)行踝關(guān)節腫脹測定實(shí)驗。參考文獻方法^[16-17],正常對照組大鼠右踝關(guān)節背側注射生理鹽水0.2 mL(關(guān)節伸直45°進(jìn)針),其余各組在右踝關(guān)節背側注射50 mg/mL MSU 混懸液0.2 mL 造模。用足趾容積測量?jì)x分別測定造模前和造模后6 h、24 h 大鼠右踝關(guān)節容積。

取1.5 節的第二批大鼠按照相同方法進(jìn)行實(shí)驗,測定造模前和造模后6、24、48 h 大鼠踝關(guān)節容積。

1.7 急性痛風(fēng)性關(guān)節炎大鼠步態(tài)的檢測

觀(guān)察并記錄1.6 節的各組大鼠造模前后的步態(tài)變化。第一批大鼠記錄造模前和造模后6 h、24 h 步態(tài),第二批大鼠記錄造模前和造模后6、24、48 h 步態(tài)。參照文獻分級標準^[17],0 級,正常行走,記為0分；1 級,輕微跛行,受試下肢略有彎曲,記為1 分；2級,中度跛行,受試下肢剛觸及地面,記為2 分；3級,重度跛行,受試下肢離開(kāi)地面,三足著(zhù)地行走,記為3 分。統計各組大鼠得分。

1.8 大鼠血清尿酸濃度的檢測

將造模后的兩批大鼠按1.5 節方法持續灌胃至5周,陽(yáng)性對照組改用LESINURAD(尿酸重吸收抑制劑,由FDA 在2015年批準與黃嘌呤氧化酶抑制劑聯(lián)用,用于治療與痛風(fēng)相關(guān)的高尿酸血癥^[18-19]),在測定前3 d連續灌胃,劑量為40 mg/kg。參考文獻方法^[20-21],末次灌胃后,各組大鼠喂食質(zhì)量分數2.5%氧嗪酸鉀飼料,分別于2 h、3 h 尾靜脈采血,3500 r/min 離心10 min 取血清,按照試劑盒方法測定大鼠血清尿酸水平。

1.9 數據處理

數據均以平均值±標準差(x ±s)表示,以SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數據統計分析,采用t 檢驗及進(jìn)行組間比較,有等級關(guān)系的采用等級序值法進(jìn)行顯著(zhù)性檢驗。

2 結果分析

2.1 黑果枸杞花青素提取物對大鼠踝關(guān)節腫脹的影響

AEL 灌胃2 周后,對AGA 模型大鼠踝關(guān)節腫脹度的影響見(jiàn)表1。由表1 可知,與正常對照組比較,模型對照組踝關(guān)節容積明顯增加(P＜0.01),表明模型建立成功。與模型對照組比較,秋水仙堿能夠明顯減輕造模后6、24 h 的踝關(guān)節腫脹(P＜0.01,P＜0.05)；AEL 高劑量能明顯減輕造模6 h 后的踝關(guān)節腫脹(P＜0.05),對減輕造模24 h 后踝關(guān)節腫脹效果不明顯；AEL 低劑量對造模后6 h、24 h 的踝關(guān)節腫脹無(wú)顯著(zhù)影響。

表1 黑果枸杞花青素提取物灌胃2 周對MSU 誘導的AGA 大鼠踝關(guān)節腫脹度的影響

ΔΔ 表示與正常對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)；*表示與模型對照組比較有顯著(zhù)差異(P＜0.05),**表示與模型對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)。

大鼠AGA 模型中,造模4 h 后大鼠踝關(guān)節開(kāi)始腫脹,6 ～8 h 達到高峰,一般可維持至24 h。本研究中發(fā)現AEL 灌胃4 周后,大鼠體重增加,造模后腫脹度明顯升高,踝關(guān)節持續腫脹,故灌胃4 周后增加了48 h 的測定時(shí)間點(diǎn),見(jiàn)表2。由表2 可知,與正常對照組比較,造模后6 ～48 h,模型對照組大鼠踝關(guān)節持續腫脹(P＜0.01)。秋水仙堿在6、24、48 h 的踝關(guān)節腫脹均顯著(zhù)低于模型組(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05)；AEL 高、低劑量均能顯著(zhù)減輕大鼠造模后6 h、24 h 踝關(guān)節腫脹(P＜0.01、P＜0.05),造模后48 h 的關(guān)節腫脹度有減小趨勢,但無(wú)統計學(xué)差異。

表2 黑果枸杞花青素提取物灌胃4 周對MSU 誘導的AGA 大鼠踝關(guān)節腫脹度的影響

ΔΔ 表示與正常對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)；* 表示與模型對照組比較有顯著(zhù)差異(P＜0.05),**表示與模型對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)。

研究表明,AEL 能夠顯著(zhù)減輕MSU 誘導的大鼠踝關(guān)節腫脹,并與攝入時(shí)間和劑量成正比。

2.2 黑果枸杞花青素提取物對大鼠步態(tài)的影響

AEL 灌胃2 周對大鼠步態(tài)的影響見(jiàn)圖1。與正常對照組比較,模型對照組大鼠右后肢彎曲,活動(dòng)減少,受試下肢離開(kāi)地面,呈三足著(zhù)地行走步態(tài)。與模型對照組比較,AEL 灌胃2 周后,AEL 高劑量能緩解造模6 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.05),AEL 低劑量對改善大鼠跛行步態(tài)效果不顯著(zhù),秋水仙堿能顯著(zhù)改善造模6、24 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.01)。

圖1 黑果枸杞花青素提取物灌胃2 周對MSU 誘導的AGA 大鼠跛行步態(tài)的影響

ΔΔ 表示與正常對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)；* 表示與模型對照組比較有顯著(zhù)差異(P＜0.05),**表示與模型對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)。

AEL 灌胃4 周對大鼠步態(tài)的影響見(jiàn)圖2。與模型對照組比較,AEL 灌胃4 周后,AEL 高、低劑量均能顯著(zhù)改善造模6 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.05),AEL 高劑量能持續改善模24 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.05)。

圖2 黑果枸杞花青素提取物灌胃4 周對MSU 誘導的AGA 大鼠跛行步態(tài)的影響

ΔΔ 表示與正常對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)；* 表示與模型對照組比較有顯著(zhù)差異(P＜0.05),**表示與模型對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)。

2.3 黑果枸杞花青素提取物對大鼠血清尿酸的影響

AEL 灌胃5 周對大鼠血清尿酸水平的影響見(jiàn)表3。與正常對照組比較,模型對照組大鼠喂食質(zhì)量分數2.5%氧嗪酸鉀飼料后2 h、3 h 血清尿酸顯著(zhù)升高(P＜0.01),模型制備成功；與模型對照組比較,AEL 高、低劑量均能明顯抑制血清尿酸升高(P＜0.05),且3 h 后AEL 高、低劑量組大鼠血清尿酸水平顯著(zhù)低于模型對照組,AEL 高、低劑量組抑制血清尿酸升高的作用相當。結果表明,AEL 對氧嗪酸鉀誘導的大鼠血清尿酸水平升高有明顯抑制作用。

表3 黑枸杞花青素提取物灌胃5 周對大鼠血清尿酸的影響

ΔΔ 表示與正常對照組比較有極顯著(zhù)差異(P＜0.01)；* 表示與模型對照組比較有顯著(zhù)差異(P＜0.05)。

3 結論

尿酸排泄減少或尿酸生成過(guò)多使得機體尿酸持續在較高水平,導致關(guān)節腔尿酸鹽晶體析出而誘發(fā)炎癥,被認為是急性痛風(fēng)性關(guān)節炎發(fā)作的關(guān)鍵病理過(guò)程^[22]。本研究發(fā)現AEL 能改善AGA 大鼠踝關(guān)節腫脹度和跛行步態(tài),同時(shí)具有降尿酸的作用,并呈時(shí)間劑量依賴(lài)性,提示AEL 能從抗炎和降尿酸兩個(gè)方面緩解大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節炎發(fā)作時(shí)的癥狀。急性痛風(fēng)性關(guān)節炎的發(fā)病機制非常復雜,后續將對黑果枸杞花青素提取物在防治急性痛風(fēng)性關(guān)節炎的作用機制進(jìn)行深入研究,為黑果枸杞花青素防治痛風(fēng)的功能性食品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據。